Objectif du test
Utilisation clinique
Détecter la résistance antivirale chez les patients infectés par le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1) ou de type 2 (HSV-2).
Contexte clinique
Le HSV est responsable des infections orales récurrentes et des infections génitales. Les manifestations cliniques les plus courantes du HSV-1 affectent les zones orofaciales et oculaires, tandis que le HSV-2 affecte la région anogénitale. Cependant, un nombre croissant d’infections génitales sont causées par le HSV-1. Chez les individus immunocompétents, les symptômes associés aux deux virus sont généralement auto-limitants, et la thérapie antivirale vise à accélérer la guérison des lésions et à prévenir la transmission. Le HSV-1 et le HSV-2 peuvent également provoquer, bien que rarement, des maladies graves, telles que l’encéphalite et les infections néonatales disséminées. Chez les patients immunodéprimés, en particulier ceux ayant des défauts dans l’immunité médiée par les cellules, les lésions herpétiques sont plus étendues, persistent plus longtemps, ont le potentiel de se disséminer et les récidives sont plus fréquentes et atypiques en apparence. De plus, le HSV peut entraîner une dissémination viscérale et une méningoencéphalite chez les hôtes immunodéprimés.
Les médicaments antiviraux disponibles pour le traitement du HSV-1 et du HSV-2 comprennent l’acyclovir (et son prodrogue valacyclovir), le penciclovir (et son prodrogue oral famciclovir), le cidofovir, le foscarnet et le brivudin. Le ganciclovir et la trifluridine ne sont utilisés que localement pour le traitement des infections oculaires dues au HSV. L’acyclovir et son prodrogue sont également couramment utilisés à titre prophylactique. Tous ces médicaments inhibent finalement la synthèse de l’ADN viral en ciblant l’ADN polymérase du HSV (codée par le gène UL30). Les analogues nucléosidiques acyclovir, penciclovir, ganciclovir et brivudin doivent d’abord être phosphorylés par la thymidine kinase virale, avant de subir une phosphorylation supplémentaire par des kinases cellulaires, ce qui inhibe finalement l’ADN polymérase virale et empêche la réplication du génome viral. La trifluridine est également un analogue nucléosidique qui peut être initialement phosphorylé par la thymidine kinase virale mais aussi par des kinases cellulaires. Le cidofovir est un analogue phosphonaté de nucléoside qui ne nécessite pas d’activation par la thymidine kinase virale pour devenir bioactif. Bien que le cidofovir ne soit pas approuvé par la FDA pour le traitement des infections à HSV, il est souvent utilisé en dehors des indications, soit sous forme intraveineuse (IV), soit sous forme topique pour traiter les infections résistantes à l’acyclovir et/ou au foscarnet. Le foscarnet est un analogue pyrophosphate qui inhibe directement l’ADN polymérase du HSV et est approuvé par la FDA pour le traitement des infections à HSV résistantes à l’acyclovir.
La réduction de la sensibilité aux analogues nucléosidiques est généralement médiée par des mutations dans le gène UL23 du HSV, qui code pour la thymidine kinase. Les types de mutations les plus courants dans ce gène viral conférant une résistance comprennent des ajouts ou des suppressions dans les chaînes homopolymères G/C, entraînant des codons de terminaison prématurés ou des décalages du cadre de lecture. Les substitutions d’acides aminés dans des régions conservées du site de liaison de l’ATP ou du site de liaison des nucléosides de la thymidine kinase virale sont moins fréquemment responsables de la résistance au médicament. Une sensibilité réduite à l’acyclovir peut également être médiée par des mutations dans le gène UL30 (codant pour l’ADN polymérase), ce qui peut également conférer une résistance croisée au foscarnet et, plus rarement, au cidofovir.
Le nouveau médicament pritelivir agit sur le complexe hélicase-primase viral composé de trois sous-unités des gènes UL5, UL8 et UL52. Il est encore en évaluation dans des essais cliniques de phase 3 et peut être obtenu par un programme d’accès élargi pour un usage compassionnel afin de traiter les infections à HSV résistantes à l’acyclovir et/ou au foscarnet.
Critères pour effectuer ce test dans le cadre des activités de référence
La gestion des infections à HSV chez les individus immunodéprimés peut être difficile en raison de la résistance antivirale. Les taux de résistance aux analogues nucléosidiques chez les personnes immunocompétentes sont très faibles (<1 %), sauf pour les infections survenant dans des sites à immunité privilégiée tels que l’œil (kératite herpétique) et le système nerveux central (encéphalite à HSV). La résistance à l’acyclovir est de plus en plus reconnue chez les individus immunocompétents souffrant de kératite herpétique. Chez les patients immunodéprimés, les taux de résistance varient de 0 % à 14 % chez les receveurs de greffes de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) et de 0 % à 3 % chez les receveurs de greffes d’organes solides (GOS). Les infections réfractaires et/ou résistantes (R/R) à HSV surviennent souvent chez les patients atteints d’une maladie avancée du VIH (taux de prévalence de 3 %–7 %), bien que les infections R/R à HSV soient beaucoup moins fréquemment observées chez les patients recevant une thérapie antirétrovirale efficace.
Les infections cliniquement réfractaires et/ou résistantes à HSV chez l’hôte immunodéprimé et les infections de l’œil et du système nerveux central chez tous les patients doivent être testées pour les mutations, suppressions et/ou substitutions dans des codons spécifiques du génome du HSV. Ces tests évaluent l’émergence de la résistance à l’acyclovir et/ou au foscarnet afin de mettre en œuvre des thérapies antivirales alternatives en fonction des tests génotypiques et phénotypiques du HSV. Étant donné que la compartimentalisation des mutants viraux de HSV se produit souvent, les échantillons de différents sites corporels (tels que diverses lésions muco-cutanées, liquide céphalo-rachidien, maladie des organes, lavage broncho-alvéolaire, œil) doivent être étudiés longitudinalement pour la résistance aux médicaments, ce qui permet également d’évaluer la dynamique virale.
Détails du test – Génotypage HSV-½
Comprend :
- Résistance au (Val)acyclovir : mutations dans les gènes UL23 de la thymidine kinase et UL30 de l’ADN polymérase du HSV-½.
- Résistance au cidofovir : mutations dans les gènes UL30 de l’ADN polymérase du HSV-½.
- Résistance au foscarnet : mutations dans les gènes UL30 de l’ADN polymérase du HSV-½.
- Résistance au pritelivir et amenamevir : mutations dans les gènes UL5, UL8, UL52 de l’hélicase-primase du HSV-½.
Description du test – Génotypage HSV-½
1. Isolement de l’ADN à partir de l’échantillon.
2. Amplification des gènes HSV-½ impliqués dans la résistance aux médicaments par PCR en fonction de la thérapie administrée au patient.
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HSV-½ gene |
HSV-½ encoded protein |
Function / drug target |
Codons sequenced (partial or complete gene sequence) |
Drug(s) for which resistance is predicted |
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UL23 |
Thymidine kinase |
Involved in activation of acyclovir, penciclovir, ganciclovir, and brivudin |
276 (complete sequence) |
(Val)acyclovir, penciclovir, famciclovir, (val)ganciclovir, brivudin, trifluridine |
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UL54 |
DNA polymerase |
Target of acyclovir, penciclovir, ganciclovir, brivudin, foscarnet, trifluridine cidofovir |
310-1100 (partial sequence) |
(val)acyclovir, penciclovir, famciclovir, (val)ganciclovir, brivudin, trifluridine, foscarnet, cidofovir |
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UL5 |
Helicase activity |
Target of pritelivir and amenamevir |
881 (HSV-1), 882 (HSV-2) (complete sequence) |
Pritelivir and amenamevir |
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UL8 |
Regulatory subunit |
755 (HSV-1), 752 (HSV-2) (complete sequence) |
||
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UL52 |
Primase activity |
1058 (HSV-1), 1066 (HSV-2) (complete sequence) |
3. Séquencement direct des amplicons par séquencement de Sanger, avec une limite de détection des sous-populations mutantes virales de 20-30 %.
4. Alignement des séquences (les séquences dérivées de l’échantillon du patient sont alignées avec les séquences du souche HSV-1 Kos ou HSV-2 G).
5. Les mutations détectées sont comparées à une base de données de mutations connues associées à la résistance aux médicaments ou à des polymorphismes naturellement occurrents (variabilité inter-souches) pour déterminer si l’infection clinique à HSV-½ est due à la résistance du virus aux médicaments.
Interprétation des résultats génotypiques HSV-½
Les résultats comprennent une liste des mutations détectées et leur association avec la résistance à chaque médicament spécifié, la variabilité inter-souches ou la signification imprévisible (changements nouveaux). En fonction du génotype HSV-½, des options thérapeutiques alternatives sont suggérées.
Un résultat de génotypage non disponible ou incomplet indique que tous les amplicons viraux n’ont pas pu être amplifiés et séquencés. Cela peut être dû à une charge virale insuffisante, à la qualité de l’échantillon (conditions de stockage et de transport, âge de l’échantillon), et/ou à la présence d’inhibiteurs de la réaction de polymérisation en chaîne.
Limites des tests génotypiques pour la résistance aux médicaments HSV-½
- Les résultats du test ne détectent pas les mutations présentes dans 20-30 % de la population virale.
- Étant donné que des artefacts génotypiques peuvent se produire, notamment dans les populations mutantes mixtes provenant d’échantillons à faible charge virale, il est conseillé de refaire le test avec un nouvel échantillon.
- Certaines variantes des gènes de la thymidine kinase et de l’ADN polymérase n’ont pas encore été caractérisées phénotypiquement et l’impact de ces changements nouveaux ne peut être prédit. Par conséquent, la combinaison des tests génotypiques et phénotypiques est nécessaire pour diagnostiquer si les nouveaux changements dans les gènes viraux sont associés à la résistance aux médicaments ou à un polymorphisme naturel.
Détails du test – Phénotypage HSV-½
- Croissance de l’échantillon viral dans des fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains (HEL) jusqu’à l’effet cytopathique (CPE) complet.
- Préparation du stock viral.
- Essai antiviral effectué dans des cellules HEL utilisant au moins deux inoculums viraux différents et la souche de référence correspondante (souche HSV-1 Kos ou souche HSV-2 G).
- Détermination de l’EC50 (concentration efficace à 50%) ou la concentration de médicament nécessaire pour inhiber le CPE viral de 50 % pour chaque médicament antiviral.
- Comparaison des valeurs EC50 entre la souche de référence et l’échantillon du patient et détermination de la résistance (rapport EC50 échantillon du patient/EC50 souche de référence).
Interprétation des résultats phénotypiques HSV-½
Les résultats comprennent les valeurs EC50 et la résistance pour différentes classes de médicaments anti-HSV, notamment les inhibiteurs de l’ADN polymérase, tels que les analogues nucléosidiques (acyclovir, penciclovir, ganciclovir, brivudin, trifluridine), les analogues de nucléotides (cidofovir et adefovir), et les analogues pyrophosphates (foscarnet), ainsi que l’inhibiteur hélicase-primase pritelivir.
Limites des tests phénotypiques pour la résistance aux médicaments HSV-½
- Les tests phénotypiques ne peuvent pas être réalisés sur des échantillons de liquide céphalo-rachidien, de fluide oculaire, de sang ou d’écouvillons électroniques en raison de l’échec de la culture du virus à partir de ces types d’échantillons.
- Pour l’isolement viral réussi, l’échantillon doit être collecté immédiatement dans un milieu de transport viral, conservé réfrigéré à 2-8°C, et transporté réfrigéré dans les 48 heures suivant la collecte de l’échantillon.
- Les mutations de résistance aux médicaments antiviraux peuvent entraîner une réduction significative de la capacité de réplication virale. Par conséquent, en cas de populations mixtes de mutants, les virus ayant une capacité de réplication inférieure seront rapidement surpassés dans la culture cellulaire par les virus ayant une capacité de réplication supérieure. L’isolement de clones viraux à partir de l’échantillon original est alors nécessaire pour évaluer le phénotype de chaque virus mutant.
Instructions pour les échantillons et le transport
https://rega.kuleuven.be/regavir/shipping
Demandes inacceptables
- Échantillon insuffisant.
- Mauvais transport ou stockage de l’échantillon.
- Formulaire de demande de test ne spécifiant pas le virus pour lequel la résistance aux médicaments doit être investiguée.
Délai de traitement (et fréquence des analyses)
Fréquence des analyses: chaque jour ouvrable, pendant les heures de travail.
Délai de réponse: 3 à 5 jours ouvrables pour les tests génotypiques.
10 à 20 jours ouvrables pour les tests phénotypiques.
Rapport des résultats des tests
Les résultats seront envoyés par e-mail selon les souhaits du laboratoire ou du médecin demandeur.