In het kort
In de afgelopen jaren zijn veel klinische laboratoria overgeschakeld naar massaspectrometrie (MALDI-TOF) om de bacteriële soorten in klinische stalen te identificeren. Deze krachtige techniek vergelijkt snel de unieke eiwit-'fingerprint' van een bacterie met een grote database, waardoor snelle en betrouwbare identificatie van soorten mogelijk is. De implementatie in mycobacteriologie is altijd moeilijk geweest, vooral door problemen met hun robuuste celwand. Daarom heeft het Nationaal referentiecentrum (NRC) voor Mycobacterium samengewerkt met MALDI-TOF-experten en geoptimaliseerde staalpreparatie. We testen bovendien de mogelijkheid om dezelfde techniek te gebruiken om de susceptibiliteit van Mycobacteria voor geselecteerde antibiotica te bepalen. Het afgeleide protocol is vrij beschikbaar voor klinische laboratoria om in hun workflow te implementeren. De prestaties van deze techniek worden momenteel onderzocht in een Europees consortium van klinische mycobacteriële laboratoria.
Projectbeschrijving
Het geslacht Mycobacterium omvat ten minste 175 herkende species met een breed spectrum van pathogeniciteit. M. tuberculosis (MTB), de belangrijkste oorzaak van tuberculose (tbc), behoort tot de grootste bedreigingen voor de volksgezondheid in lageloonlanden. Volgens het laatste WGO-rapport staat tbc nu naast hiv als belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd, met een geschatte 9,6 miljoen nieuwe gevallen in 2014 en 1,5 miljoen sterfgevallen. Terwijl MTB een obligaat pathogeen is, zijn niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM's) milieu-organismen die af en toe als opportunistische pathogenen optreden en tot een groot aantal klinische syndromen leiden. Het aantal gerapporteerde gevallen van NTM-infecties is het afgelopen decennium spectaculair gestegen, wat te maken heeft met een toenemend aantal immuungecompromitteerde patiënten, de implementatie van geavanceerde diagnostische hulpmiddelen en het toegenomen bewustzijn van de rol van NTM's bij ziekten. Maar slechts 29 van de > 160 erkende NTM-soorten zijn geassocieerd met menselijke ziekte; andere (zoals M. gordonae) zijn veel voorkomende contaminanten uit stalencollectie of -verwerking. Diagnostische laboratoria zouden daarom een identificatie op soortniveau moeten uitvoeren om de klinische significantie van een mycobacterieel isolaat in klinische stalen vast te stellen. De traditionele identificatie van mycobacteriële species berustte vooral op fenotypische en biochemische eigenschappen. Meer recente methoden zijn de chromatografische analyse van mycolzuurprofielen of het gebruik van DNA-probes die tegen het meest voorkomende Mycobacterium spp gericht zijn. Tot op heden blijft de gouden standaard voor speciesidentificatie DNA-sequencing van 16S rRNA, rpoB en/of hsp65-genen. Deze methoden zijn echter duur, kunnen arbeidsintensief zijn, specifieke apparatuur en expertise vereisen en zijn vaak beperkt tot referentielaboratoria.
Dezelfde complexiteit is te vinden in de mycobacteriële geneesmiddelensusceptibiliteitstests (DST), die op kweek gebaseerd en tijdrovend is. De huidige gouden standaard voor MTB is het MGIT960/TBeXiST-platform, dat groei op basis van zuurstofverbruik meet. Recent ontwikkelde moleculaire technieken kunnen snel genetische resistentiemarkers in MTB detecteren, maar elimineren de noodzaak van op cultuur gebaseerde susceptibiliteitstests niet voor het volledige spectrum van beschikbare tbc-geneesmiddelen. Voor NTM-stammen is microdilutie in vloeibare bodem aangewezen als aanbevolen methode. Er zijn echter grote verschillen tussen in-vivobehandelingsuitkomst en in-vitrosusceptibiliteiten gemeld, en de paar breukpunten die zijn vastgesteld, hebben weinig klinische bewijsbasis. Als gevolg hiervan gebruiken de meeste diagnostische laboratoria de oude agarproportiemethode of commerciële platforms voor microdilutie op vloeibare bodem om de minimaal inhiberende concentraties (MIC) voor verschillende antibiotica vast te stellen. De interpretatie van dit laatste is echter lastig voor langzaam groeiende mycobacteriën en bovendien gevoelig voor interlaboratoriumvariaties. Bovendien is het rapport van een MIC-waarde op zich zonder een begeleidend klinisch breekpunt vaak nutteloos voor de arts.
De laatste jaren is behoorlijke vooruitgang geboekt bij de toepassing van matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatietijd van vluchtmassaspectrometrie (MALDI-TOF MS) voor speciesidentificatie in mycobacteriologie. In tegenstelling tot de meeste bacteriën vereisen mycobacteriën voorafgaande inactivatie en disruptie van de mycolzuurrijke celwand, zowel om bioveiligheidsredenen als om de cellulaire proteïne-inhoud vrij te geven.
In dit project onderzoeken we de mogelijkheden om MALDI-TOF te gebruiken bij de identificatie van species en DST-tests van mycobacteriën.
